实验工具

（首次实验须准备）

饭盒

• 要一个玻璃饭盒放置工具并倒入benz-all浸泡消毒，其中Benz-all配比：半瓶原装Benz all并将水加到2L。

电极

• 记录一般用玻璃电极（阻抗较大，能记录到Single-Unit），电刺激用钨丝电极（阻抗较小，能记录到Multi-Unit）

钻头

• 拧上螺丝，装入电钻进行测试

骨蜡

网格（Grid）

• 如果使用的是别人的猴子，要注意grid的洞的编号方式（不同的人使用习惯不同），包括是从0还是从1开始编号，正负号表示前还是后。
• 如果使用的是新猴子，可以用实验室已有的grid或者自己重新设计，然后将图纸交给工厂代工。常用参数：两行孔之间的距离是0.8mm，而两张相邻的核磁图对应的脑截面间隔距离是0.75mm或0.5mm

导管（Guide tube）

• 剪一段粗管子，约2cm长（打磨过程会消耗部分长度），两头用打磨机磨平，用砂纸去尖刺
• 剪一段细管子，约5-6cm长（打磨过程会消耗部分长度），如果不知道脑区深度，先要做一系列的长度，大概是1.5cm到3cm。一头用打磨机磨平，一头用打磨机磨出针筒尖端的形状，用砂纸去尖刺，并且用细金属丝贯通整段管子。
• 把粗管子套在细管子上，上方露出约1cm的细管子，在上方粗管子和细管子的连接处涂抹电焊液，用无铅焊锡焊接连接处，使粗细管子连接上。
• 剥一条约12cm长的彩虹线（做电线用），去掉两头的绝缘层，并把其中一头在粗管子上打结，类似3中的方法，把彩虹线焊接在粗管子上，焊好后把彩虹线在粗管子上绕几圈，这样线不容易断掉

准备电极（10min）

提前打开仪器

• 除了打开平时训猴子用的仪器（TEMPO server、TEMPO client、stimulus machine、MOOG、眼动追踪仪、监控摄像头）外，还要打开前置放大器、CED、声音转换器（听spike）和微操（下电极）。

创建无菌环境

• 反扣饭盒盖，放置两个展开的纱布，喷洒酒精

准备钻头

• 取出钻头，喷洒酒精，用纱布擦拭干净，尤其是尖端螺纹处（异物都被卷到里面）

准备网格

• 根据脑区定位与实验需要，确定下电极的洞的坐标
• 取出grid，用纱布擦拭，用油性笔标记待下电极的洞的位置。

准备电极

•  新电极预处理
  • 先剪去尾部一部分，保留约9-10cm长的部分（经验值，这个长度适中，太长不方便操作，太短微操夹不到；微操最长能走15000μm，也就是1.5cm，如果脑区稍深，电极需要保留长一点，跟随guide tube先插一部分到组织中）。
  • 如果是钨丝电极，则用打火机烧掉尾部的绝缘层（约2cm）；如果是玻璃电极，则用剪刀剪碎尾部玻璃外壳（约2cm），使金属部分暴露出来，以导出信号。
• 观察
  • 喷洒酒精，用喷洒过酒精的纱布从后往前擦拭电极。然后再显微镜下观察尖端是否是三角锥，如果有缺口，请更换电极；如果有异物，在顺着电极快擦拭到尖端的地方时稍微用力，以去掉异物。
• 测阻抗：
  • 打开阻抗表开关，调量程为5MΩ，用夹子夹住电极尾部，把电极1/4-1/3长度都泡在生理盐水里，观察示数。电刺激用的钨丝电极理想阻抗大约为500KΩ（经验：100-700KΩ也能记录），单细胞记录用的玻璃电极理想阻抗大约为1.5MΩ（经验：0.5-2MΩ也能记录，小于1MΩ可能难以记到single unit）。测完后记得关！闭！电！源！，否则电池很快耗完。
• 故障排查：
  • 如果电极阻抗太小（在5MΩ量程下近乎0）→更换电极。原因可能是玻璃电极的玻璃外壳破裂了，导致电极短路。测阻抗时把电极从尖端慢慢伸进生理盐水，可以观察示数变化判断玻璃外壳破裂的地方。
  • 如果电极阻抗太大（>2MΩ），电极尖端有脏东西，需要擦拭干净。刚开始下电极做记录时，由于沾到脏东西，阻抗会变得很大，这时候可以先下电极500-1000μm，看看能不能弄掉脏东西使电极阻抗变正常，如果实在不正常再重新拔出电极擦拭。
• 把电极搁在饭盒，尖端朝外（切记碰到尖端），使酒精挥发。

准备导管

• 确定长度：取出guide tube，测量并记住guide tube 的长度。靠近中线的洞（譬如VIP、LIP），一般先用较短（譬如扎LIP一般用2cm，具体值可借鉴师兄师姐的实验经验值）的guide tube（以戳破硬脑膜为准），外侧的洞（譬如MST）所用的长度逐步加长。下图比例不准确，只供示意。（一层灰质的厚度约2000μm，即2mm）
• 清理：把酒精瓶的嘴对着guide tube的嘴注入酒精清洗；再用浸泡在banz all中的金属线捅干净里面的异物；接着甩干guide tube中的酒精并且用生！理！盐！水！冲！洗！（避免残留酒精杀死神经元，以保持该洞的神经元活性），最后用纱布擦拭干净guide tube。
• 插入电极：刮一点骨蜡，揉成椭球状，插在guide tube 尾部（用于黏住电极，使它不会掉出guide tube）。把电极顺着尾部插入guide tube尖端，使得电极尖端与guide tube尖端平齐，测量粗管子以上的部分（相当于grid以上部分）电极长度，记住数值大小（大约8cm，后面用到）。测量之后，把电极拔高，使得尖端藏于guide tube 内部（以防尖端外露被碰坏）。把guide tube平放在饭盒盖纱布上。

拉猴子（10min）

拉猴子前准备工作

• 开！空！调！保证20℃的恒温环境
• 垫纸：记得在猴椅下放置草纸，否则猴子拉屎撒尿会搞得一塌糊涂
• 加水：准备水或果汁，并将水管中的气泡排掉

消毒钻孔（15min）

固定头部

• 上头柱→固定chamber并加固螺丝→打开chamber

消毒

• 加双氧水泡5min，期间最好用闲置的guide tube捅一下扎过的洞，清理一下异物。用纱布吸干净双氧水，加碘伏泡10min。

固定网格

• 注意轻拧螺丝至稍紧状态，用螺丝刀左右轻碰grid，只要grid没有侧翻就可以。

钻孔

• 如果该洞已经钻过，则直接用钻头旋转向下，把异物卷出即可，可不重新打洞。如果是新的洞或者很久不扎的洞，则按下面操作钻孔：
• 安装钻头：按住电钻前段按钮，插入钻头，扭紧钻头，放开按钮；
• 检查钻头：钻头朝地面，打开电钻开关，观察电钻有没有摇晃形成椎体，有的话则要重新安装钻头甚至更换钻头；
• 钻孔：钻孔时双手手掌侧面靠着猴椅头柱基座，先把钻头插入grid中，然后手指上下运动，钻头首先钻穿牙科水泥，然后再钻穿头骨（比牙科水泥硬），当手部有“落空感”时拔出电钻，用导管检查是否已经穿透头骨，如果没有的话继续钻。

固定导管和微操基座

• 把导管放在刚钻好的孔上，安装微操的基座。用胶布把导管的地线粘到猴椅头柱的底座上，以防之后接地线时牵扯到电极。

接线（5min）

把猴子抬上平台

• 注意：身体不能碰到电极，以防电极扎到组织去），接上水嘴（接上后用手轻轻摇一摇，确保拧紧）

测量网格上电极长度

• 将电极下降一定的长度，使得电极在grid上的部分长度正好为前面的测量值，保证电极刚刚在guide tube 尖端。

固定微操基座

• 先大致（不用太紧）固定微操到底座上，调整微操使电极末端能够自然地（而不使电极弯曲倾斜）贴着导出信号的金属夹片上，拧紧固定微操的螺丝，再把夹片夹紧电极。

接线

• 接上眼信号线（插plug）
• 信号线：蓝盒子红线（带有金属屏蔽网）插在微操上电极信号输出端；黑线夹在guide tube的地线上（形成回路）。
• 接地线降噪：信号线金属屏蔽网接地，微操架子（一头夹在上面的微操架子的螺丝上，另一头可夹在信号线屏蔽网上或者直接加到前置放大器的地线夹子上）接地，锡箔纸板（罩着电极、微操等）接地。

下电极找细胞

打开设备

• 微操、CED、前置放大器

打开Spike2

• 打开特定的configuration（如果第一次实验，需要先设置好configuration，包括信号采集通道和分析窗口），点击sample data → start，按show/hide channel按钮选择需要观察的channel。先观察噪音（同时听声音转换器）是否太大（正常情况下SD=0.004，0.002-0.005也正常）；如果噪音太大（SD超过0.005且波形不像动作电位），按照下面的方法进行排查。当然，有时候波形是正常的，说明电极已经插到组织里面（神经元胞体或轴突），这时候已经在收集信号了。

噪音很大的原因（★）

• 钻洞的原因：钻洞没有钻透，新洞的硬脑膜没穿透或者老洞上的脏东西没有钻走，导致断路，在线测阻抗大于5M。最简单的解决办法是手动下电极1-2mm，如果下不去再用guide tube捅破，如果再下不去，就用电钻重新钻一次。
• 接线的原因：可能是夹电极的夹片没有夹到电极或者夹到绝缘层（玻璃电极的玻璃或钨丝电极的绝缘涂层），或前置放大器的地线夹子没有夹好Guide tube的引线（松了，或者夹到导线绝缘层）；如果是平台动的时候或者猴子动的时候，噪音特别厉害，很有可能是前置放大器的地线和其它引线没有固定好，需要用胶布固定好各根导线，使其不容易被扯动。
• guide tube的原因：可能是因为guide tube的引线是由多股细丝组成，而这些细丝没有拧成一股，导致信号不同的金属细丝上的信号相互干扰（？）。解决办法：将由多股细丝组成的引线换成单股金属丝的引线，或者将多股细丝拧成一股
• 环境噪音源的原因：灯泡坏了、外面有电瓶车充电都会有噪音干扰，可用锡箔纸板罩着作电磁屏蔽
• 信号线或地线的原因：信号线或地线可能因氧化或拉扯等原因导致部分断裂，当接触不良时造成噪音，这需要重新焊接信号线或地线
• 注意：没有接信号线前不能打开放大器（BAK），准备拔信号线前必须先！关！掉！放！大！器！，否则都会因信号过大损坏前放！

 找细胞

• WM：在白质中时，可大步下电极（continue模式，步长100，即CON 100），记录本上记录：GM。
• close to sth.：如果开始有spike，则表示进入灰质（笔记本上记录：GM），缩小步长（continue模式，步长50，即CON 50），慢慢接近细胞。记录本上记录：close to sth.。
• GM：如果信号发放强烈，则表示电极尖端已经入灰质层。记录本上记录：GM。
• SU：如果遇到较大（幅度较大）并且较纯（可与其他细胞分离开来）的细胞——这样的细胞容易长时间hold住不容易中途丢掉并且信号可分有利于实验分析，即可开始记录。记录本上记录：SU，并在sorting之后画出波形。
  • 阈值的选取没有严格标准，只要能够分离出较大较纯净的细胞即可。粗略地，找MU或信号较小时用3倍SD（信号幅度的标准差），找SU或信号较大时用6倍SD。
  • 分离细胞（sorting）的方法：菜单栏analysis或者鼠标右键→edit WaveMark→划阈值（鼠标中间滑轮+左键）→勾make template→选完后去掉make template→update），分出不同的细胞。
  • 注意电极尖端与细胞需要保持一个安全且能记录到纯净信号的距离，如果信号变小，那么先退回电极，因为这样必定不会刺伤细胞，如果信号继续变小了，那么就慢慢地下电极，以靠近细胞。
  • 补充——Spike2快捷键：快捷键ctrl+Q将波形缩放至合适大小，ctrl+E将时间轴压缩，ctrl+R将时间轴放大。end时间轴移到当前。

没有信号的原因（★）

• 导管的原因：导管没有捅破硬脑膜（下到深处后，电极会变弯），需要用更长的导管
• 电极的原因
  • 阻抗太大，导致只能记录很强的信号，所以看上去似乎收集不到信号。阻抗大的原因。在线测阻抗很大的可能是夹子夹到绝缘层去了，需要把绝缘层多剥离一些，使夹子夹住电极的无绝缘层部分。如果不是绝缘层的问题，那就先下电极看看，如果阻抗还是很大，需要重新拔出来擦干净。
  • 阻抗太小，记录不到信号。阻抗太小的可能原因：玻璃电极的玻璃层破裂，导致短路，需要更换电极；Guide tube尾端过长或电极绝缘层剥离过多，导致guide tube尾端与电极无绝缘处接触，引起短路；电极尖端磨损变平，需要更换电极。
  • 注：电极的阻抗主要集中在尖端，所以阻抗的变化主要是尖端变化造成的
• 脑区的原因
  • 脑区被重复扎，细胞活性不高（同样的洞要隔至少两周才能再次扎，等周围的组织填充过去）
  • Guide tube用酒精冲洗后，没有甩干或者用生理盐水冲洗，使得guide tube上的酒精杀死了神经元
  • 扎到白质上了（尤其是在扎皮层沟回的尖端时会扎过了）
  • 下面有异常组织，阻力较大，电极并没有下去（下到深处后，电极会变弯）

通过电生理的特性定位脑区

测感受野

• 打开RFPlot：在Moogdots点击low priority（使optic flow的视觉刺激的优先级降低，RFplot给的视觉刺激优先级提高）→打开RFPlot，点击Random dots给视觉刺激。在Tempo点击RF Plot并开始，使得屏幕出现注视点，让猴子开始盯点（注意：猴子必须盯点，否则没法准确测RF）。
• 确定RF：先在RFPlot中调节视觉刺激出现模式为flick，把光点刺激调成较窄（譬如5°）横向（或竖向）长条状，听声音确定有Visual modulation（实验记录本上记录：VM，神经元随视觉刺激的闪烁有一阵一阵发放）横向（或竖向）范围，然后换成较窄竖向（或横向）长条状，沿着刚才确定的横向范围听声音确定有Visual modulation的竖向（或横向）范围，从而确定RF的大小，记录RF中心的位置和长宽。MSTd神经元的RF约有1/4屏幕大。
• 注：由于第一套系统有bug，需要先打开Tempo，让猴子做任务，使得平台先动起来，否则平台就会掉下去。Tempo快捷键：给水快捷键F3，暂停快捷键F2

测调谐曲线

• 在tempo中按1D Azimuth Tuning，在Spike2按GCD_Samp（具体操作视使用的系统与代码而定），画出tuning曲线。注意在tempo中按save保存数据，在spike2中保存电生理的数据（具体操作视使用的系统与代码而定，有的系统可以与tempo的数据一并自动保存）。如果p值很小（tuning显著），则可以做进一步实验。

测集群情况

• 在上下（相隔100微米）三个site测出tuning。如果tuning比较一致（都是左或者都是右），说明集群（clustering）情况良好回到中间的site，做有/无电刺激的interleave的行为学实验。

各个脑区的定位方法

• MT：①给全屏的random dots，会有很强的visual modulation，但receptive field较小（直径10°）；②有显著的视觉tuning，但没有显著的前庭tuning；
• MST：①给全屏的random dots，会有很强的visual modulation，而且receptive field较大（直径60°）；②一般有显著的视觉tuning，也可能有显著的前庭tuning；
• VPS：①直接测前庭tuning，一般有显著的前庭tuning，可能有显著的视觉tuning；②如果用random dots，可以听到较强的visual modulation，其receptive field也比较大（直径60°）；
• PIVC：①直接测前庭tuning，有显著的前庭tuning，但没有显著的视觉tuning；
• LIP：①需要不断调整给random dots范围（位置和大小），以捕捉到微弱的visual modulation；②做memory saccade，调整ecc（10°-30°）做八个角度的memory activity，如果有两个相反的方向的memory activity有显著的差异，那么才算是典型的LIP细胞（实际上有很多不典型的，这些细胞都不要）；③如果memory activity非常显著，那么按照memory saccade得到的ecc和ang值做任务，很有可能看到ramping；
• FEFsac：①在前额叶位置，如果电刺激能够诱发saccade，那么可以确定是FEF saccade，之后不需要再做电刺激，只要在附近区域做记录即可；②做memory saccade，调整ecc（10°-30°）做八个角度的memory activity，如果有两个相反的方向的memory activity有显著的差异，那么才算是典型的LIP细胞（实际上有很多不典型的，这些细胞都不要）；③如果memory activity非常显著，那么按照memory saccade得到的ecc和ang值做任务，很有可能看到ramping；

实验记录

在操作的同时做好实验记录——在什么深度遇到什么情况，做了什么实验

• 实验基本信息：日期、猴子名称、实验者名称（有时候不是同一个实验者）、实验名称、第几次实验（session）
• 电生理实验参数：所扎的洞的位置，guide tube 长度，grid以上的电极长度（电极下多了小少了要注明offset是多少），电极阻抗（打开前置放大器先测量阻抗），初始信号基线值（用信号的标准差来衡量，SD在0.004-0.008为可接受的噪音范围）
• 灰白质：快进入灰质有零星spike写“close to sth”，确认进入灰质写“GM”，安静了写“Silent”，确认出了灰质写“Out”
• VM：听到比较微弱的模糊的VM写“Weak VM”，清晰但不强的VM写“VM”，很强烈的VM写“Strong VM”。画RF大概位置，记录中心位置和长宽信息。
• Tuning：画出tuning的大致形状并标出显著性（打星号）或写明p值，记录数据文件的编号。
• 行为学：记录刺激参数（第一次实验或有参数变更时要注明，平时可省略。行为参数：角度范围，coherence，amplitude，num_sigmas，duration），记录行为结果（bias，threshold）最好画出心理物理曲线简图

收尾工作

• 退电极：将电极退到导管尖端（退到不能退为止），这时微操显示“R”，然后按“0”归零。
• 开灯前收拾必须关！闭！放！大！器！
• 接线前稍微拔高一下电极，解除接线，解除水嘴，抱下猴子
• 解除微操基座，拔下导管，摘下grid（直接放在Benz-all中浸泡），泡5min双氧水，然后泡10min碘伏，在泡的期间，同时清洗电极以及导管
• 清创，剪毛，抹眼药膏